方剂药效物质基础研究是中医药现代研究的难点,其研究思路与方法尚在探索之中。1999年以来,国家科技部及国家自然科学基金持续将方剂药效的物质基础研究列为重大攻关项目。南京中医药大学江苏省方剂基础和应用研究重点实验室的陆茵教授在本次会议上介绍了一些新的经验和方法。
利用细胞生物色谱分析方剂血清中的活性成分色谱、光谱技术在中药成分分析中的应用,极大地推动了中药及其复方成分的研究。然而,效应与成分关系的研究难度在于难以得到一定量的可供效应分析化合物,微量及纳克级的化合物效应分析技术不容易建立。细胞膜固相色谱技术就是在这一背景下诞生的。细胞膜固相色谱技术与一般生物色谱技术的不同点在于,90%以上生物靶点存在于细胞膜上,比应用单一受体或离子通道更能体现方剂的效应及方剂化学成分复杂性。细胞膜固相色谱技术的基本原理是,药物效应的产生是由于药物分子与细胞上的生物大分子(如受体)结合,激活了生物信号放大系统。南京中医药大学江苏省方剂基础和应用研究重点实验室首先采用红细胞膜固相色谱分析当归提取液的成分,得到了洋川芎内酯等化合物,用血小板固相色谱法分析丹参注射液和脉络宁注射液的成分,得到了丹参素、原儿茶醛、绿原酸类等一群化合物。研究提示细胞膜固相色谱是一个快速、简便、高效的效应-物质基础的研究方法。
利用Caco-2细胞分析
有效组分的吸收过程在进入血清之前,方剂的有效成分可能有数种来源:药材固有的化学成分;加工炮制和煎煮过程的产物;肠内菌代谢产物。人肠上皮细胞系(Caco-2)细胞来源于人体结肠腺癌细胞。由于Caco-2细胞在培养条件下可自发进行上皮样分化并可形成紧密联结,其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠相似。在分析血清中方剂配伍有效成分的改变与效应关系研究之前,可以对方剂中各种配伍关系进行测试成分组渗透Caco-2细胞或MDCK(Madin-Darbycan-ineKidney)细胞膜的能力,来简单模拟方剂有效组分在肠道中吸收的过程,以预测方剂中成分组在体内的吸收过程,研究各成分组合(方剂配伍后)对吸收的影响作用和小肠内各代谢酶对方剂中各组分间的影响。
利用报告基因的方法分析血清中效应成分的改变
基本思路是方剂配伍的变化而导致血清中化学成分的改变,因而其效应也发生改变,效应的变化可以通过细胞中的报告基因表达出来。该思路的提出可能简化方剂作用物质基础的研究。基本步骤为:在动物经多次给药体内达到稳态的血药浓度后,采集血液、分离血清,以含此药物成分的血清进行含报告基因的细胞体外实验;构建带有基因效应元件与荧光素酶基因(报告基因)质粒,转染细胞筛选稳定表达的细胞系,通过荧光素酶量的变化从而可知方剂中的活性成分调控下游基因的表达,从而检测出方剂血清中的效应成分改变与效应之间的关系。