不同提取工艺对中草药抑菌效果的影响

摘要：本试验选用10种中草药，采用水温浸法、稀碱（酸）溶液温浸法、乙醇回流法等提取工艺，研究不同工艺的提取物对大肠杆菌（K88）的抑菌效果。结果显示，黄芩碱水温浸法与秦皮乙醇回流法提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直径分别为13.46+1.17mm和13.47+1.19mm。
关键词：中草药 提取工艺 大肠杆菌 抑菌试验

大肠杆菌（K88）是养猪生产中的主要致病菌，能引起多种疾病。受大肠杆菌（K88）感染的仔猪，常表现为发热、腹泻、食欲减退等症状，严重时以至死亡。当前最普遍的防治方法是使用抗生素。由于致病菌易对抗生素产生抗药性，抗生素加大用量也会引起畜产品安全性问题。因此，研究抗生素的替代品具有重要意义，中草药即为有效替代品之一。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种 猪大肠杆菌（K88）由中国兽药监察所提供。
1.1. 2试验药物 黄芩、秦皮、苦参、十大功劳、威灵仙、白头翁、鱼腥草、穿心莲、马齿苋、进口牛至油（含量99.6%）。
1.2. 3提取工艺
（1）水温浸法：取各药材粗粉100克，分两次温浸，第一次加入7倍量的蒸馏水80℃温浸4h，第二次加入5倍量的蒸馏水80℃温浸2h，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加3倍量的95%乙醇沉淀24h，3000n/t离心10分钟，取上清液，减压浓缩干燥，得膏状物即为提取物。
（2）碱（酸）水温浸法：取各药材粗粉100克，分两次温浸，第一次加入7倍量的蒸馏水调pH值为10（或2），于80℃温浸4h。第二次加入5倍量的蒸馏水，调pH值同上，于80℃温浸2h。合并滤液，调pH值至7，减压浓缩，浓缩液加3倍量的95%乙醇沉淀24h，3000n/t离心10分钟，取上清液，减压浓缩干燥，得膏状物即为提取物。
（3）乙醇回流法：取秦皮粗粉100g，放入自制回流装置内，分两次回流，第一次加入7倍量的乙醇，回流6h，第二次加入5倍量的乙醇，回流4h，合并回流液，减压浓缩干燥，得膏状物即为提取物。
（4）水蒸汽蒸馏法：称取一定量的药物粗粉，放入自制蒸馏装置中，加入5倍量蒸馏水，蒸馏至无油状液体馏出为止，后加乙醚萃取，减压回收乙醚得挥发油。
1.1.4培养基
营养琼脂
营养肉汤 自制取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g加蒸馏水1000ml，调pH值至7.8。
1.2试验方法
1.2.1菌种活化将保存菌种接种于营养肉汤中，37℃培养18小时,用灭菌生理盐水稀释培养菌液,使其浊度达到9×108(相当于麦氏比浊管第3管)。
1.2.2 药液配置取膏状提取物用蒸馏水稀释至相当于生药含量2g/ml，灭菌后备用。取1ml99.6%牛至油溶于100ml蒸馏水中，加入2ml吐温?80，搅拌使其充分溶解，配制成1/100的溶液备用。另取2ml吐温?80溶于100ml蒸馏水，作为空白对照组。
1.2.3纸片扩散法 选用定性滤纸用打孔器制成6.00mm的小圆纸片，高压灭菌后放入灭菌药液中浸泡1~2h，真空干燥，均匀贴在已涂布菌液的营养琼脂平板表面。每种药液制作18片含药纸片，每个平板贴6片,共贴3个平板。37℃培养18h后，测量抑菌圈直径。

2 试验结果
纸片法抑菌结果见表1。十种药物均有抑菌活性，不同提取工艺对抑菌活性的影响很大。黄芩碱水温浸法与秦皮乙醇回流法提取物的抑菌效果最佳，抑菌圈直径分别为13.46+1.17mm和13.47+1.19mm。黄芩与秦皮其他工艺的提取物的抑菌效果亦优于其他药物，说明黄芩与秦皮对大肠杆菌的抑制作用最强。其余药物的抑菌活性相对较弱。白头翁、威灵仙、穿心莲乙醇回流法提取物无抑菌活性。十大功劳蒸馏水温浸法提取物无抑菌活性。乳化剂吐温?80无抑菌活性，表明对抑菌试验无影响。
表1 不同提取工艺对大肠杆菌的抑菌效果

注：同一种药物不同工艺的抑菌圈直径，上标不同表示差异显著（p<0.05）

3小结与讨论
3.1用纸片法进行抑菌试验，同组内抑菌圈直径有所差异，而且有的抑菌圈呈不规则的椭圆形，究其原因，纸片中的药物在琼脂培养基中扩散不均匀。为抑菌圈直径的测量造成困难。本实验采用对抑菌圈直径进行多次测量，取平均值的方法，基本上消除试验误差。
3.2本试验根据每种药物中抑菌成分的化学性质设计了2~3种提取工艺，从试验结果可以看出，不同工艺对抑菌效果影响显著。提取工艺的抑菌效果好，说明此种工艺可有效的提取药物中的抑菌成分。此试验结果与抑菌成分的化学性质基本相符，但穿心莲内酯不溶于乙醇而溶于水与有关文献报道有所差别。
3.3十种药物中黄芩与秦皮的抑菌效果最好，价格较高。白头翁、大青叶、马齿苋的抑菌效果相对较差，价格也相对便宜。白头翁与威灵仙的抑菌成分同为白头翁素，但威灵仙的抑菌效果不及白头翁，可能由于白头翁中白头翁素的含量相对较高。苦参与十大功劳所含小檗碱微溶于水，苦参蒸馏水温浸法有抑菌活性而十大功劳没有，也可能由于苦参中小檗碱含量高于十大功劳。牛至油稀释至1/50的抑菌效果好于稀释至1/100，说明浓度与抑菌效果成正比，浓度越高抑菌效果越好。
作为抗生素的替代品，主要目的是能抑制或杀灭有害细菌，促进动物生长。抑菌效果好坏直接影响到添加剂的作用效果，设计合理的提取工艺是稳定产品质量及产业化的重要途径。本试验在中草药饲料添加剂的开发方面做了初步的探索，但由于对药物抑菌成分理化性质了解不深入，在工艺设计方面还需进一步完善。

参考文献
1.卓然主编.医学微生物实验学.北京：科学出版社，1998
2.启寿编著.中药成分化学.北京：科学出版社，1977
3.姚新生主编.天然药物化学.北京：人民卫生出版社，2001
4.高微微等.中草药提取物对沙门氏菌的抑菌试验.中兽医医药杂志，1999,（4）：11~13
5.夏薛梅等.中草药对大肠埃希氏菌的抑菌试验.中兽医学杂志，1998，92（3）：5~7

作者：
侯永清，武汉工业学院饲料科学系，教授，博士，430023，武汉市汉口常青花园中环路特1号。（027）83956175
张挺，单位及通讯地址同第一作者。